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摘要

ABSTRACT

符号和缩略词说明

第一章 绪论

1.1 酿酒酵母细胞工厂

    1.1.1 酿酒酵母代谢工程

    1.1.2 酿酒酵母合成生物学工具的应用

        1.1.2.1 CRISPR-Cas9 技术在细胞工厂中的应用

        1.1.2.2 单碱基编辑技术

        1.1.2.3 重组蛋白表达技术

1.2 酿酒酵母中的脂类代谢和脂滴

    1.2.1 脂类代谢

    1.2.2 脂滴组分

1.3 萜类化合物

    1.3.1 酿酒酵母的甲羟戊酸途径

    1.3.2 萜类化合物在酿酒酵母中的合成

    1.3.3 萜类化合物的存储和发酵培养

1.4 酿酒酵母的发酵底物

    1.4.1 碳源的来源与应用

    1.4.2 蔗糖转化酶

1.5 本论文研究背景、意义及内容

    1.5.1 研究背景和意义

    1.5.2 研究的主要内容

第二章 异源生物合成β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

    2.2.1 菌株,质粒和引物

    2.2.2 生化试剂与药品

    2.2.3 仪器与设备

2.3 实验方法

    2.3.1 培养基和培养条件

    2.3.2 PCR扩增基因片段

    2.3.3 同源重组整合β-胡萝卜素合成途径

        2.3.3.1 YZ01 菌株的构建

        2.3.3.2 YZ02 菌株的构建

        2.3.3.3 YZ03 菌株的构建

    2.3.4 PCR扩增构建p2CRT质粒的基因片段

    2.3.5 β-胡萝卜素的提取与定量分析

2.4 结果与讨论

    2.4.1 pMRI21-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒和pMRI31-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒的构建

    2.4.2 酿酒酵母β-胡萝卜素合成途径的引入

    2.4.3 产β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建

    2.4.4 高拷贝p2CRT质粒的构建

    2.4.5 游离型质粒对β-胡萝卜素生产的影响

2.5 本章小结

第三章 脂类代谢途径改造对萜类化合物积累的影响

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

    3.2.1 菌株,质粒和引物

    3.2.2 生化试剂与药品

    3.2.3 仪器与设备

3.3 实验方法

    3.3.1 培养基和培养条件

    3.3.2 CRISPR质粒的构建和供体的制备

    3.3.3 酿酒酵母电转化与基因型验证

    3.3.4 产α-葎草烯的异源代谢途径引入

    3.3.5 强启动子表达限速酶基因

    3.3.6 ERG1 启动子控制ERG9 基因的表达

    3.3.7 β-胡萝卜素的提取和HPLC-UV定量分析

    3.3.8 酵母细胞中β-胡萝卜素分布的显微镜观察

    3.3.9 磷脂类的提取和LC-MS定量分析

    3.3.10 α-葎草烯的定量分析

3.4 结果与讨论

    3.4.1 重新定向脂类代谢网络影响β-胡萝卜素的积累

    3.4.2 磷脂酸磷酸酶缺失增加了β-胡萝卜素的产生

    3.4.3 甾醇酰基转移酶的过表达增加β-胡萝卜素的积累

    3.4.4 组合多种策略进一步增加β-胡萝卜素的积累

    3.4.5 α-葎草烯工程菌株的成功构建

    3.4.6 工程改造α-葎草烯生产菌株的代谢网络

3.5 本章小结

第四章 酿酒酵母中蔗糖转化酶突变体的构建与应用

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

    4.2.1 菌株,质粒和引物

    4.2.2 生化试剂与药品

    4.2.3 仪器与设备

4.3 实验方法

    4.3.1 培养基与培养条件

    4.3.2 Golden Gate克隆反应系统和程序

    4.3.3 质粒构建

    4.3.4 重组蛋白的表达和纯化